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本制品具有RNA和DNA依赖的聚合酶活性，但是却没有RNase H活性（该活性区域点突变），RNaseH可以特异性的水解DNA-RNA杂合链中的RNA，去除RNase H的活性可以有利于提升cDNA合成的长度。该酶不能降解第一链cDNA合成时形成RNA-DNA复合物中的RNA，因此可获得全长的cDNA。高产量制备全长的第一链cDNA，最长可达15kb，37～42℃范围具有最佳活性，温度高达50℃时仍有活性。M-MuLV Reverse Transcriptase（RNase H-）在宽的温度范围（37～42℃）内有酶活性，因此适合逆转录具有较多二级结构的RNA分子。

• 第一链cDNA合成，用于RT-PCR和实时RT-PCR。
  
• 合成cDNA，用于克隆和表达研究。
  
• 制备芯片研究用标记的cDNA探针。
  
• DNA标记。
  
• 引物延伸法分析RNA。

• 抑制剂：金属螯合剂、无机磷酸盐、焦磷酸和多胺、尿素和巯基类试剂。
  
• 失活：85℃加热5min。

• 实验过程中注意避免RNase污染，RNA样品要避免基因组DNA污染。用于cDNA合成的器具须用0.1% DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液37℃浸泡12h；然后在120℃高压灭菌30min去除残留的DEPC。
  
• RNA模板的完整性对cDNA合成效率起着决定性作用，请选择可靠的RNA提取/纯化方法制备高质量的RNA模板，并设置反转录反应阳性对照。
  
• 由于所有的RNA提取方法都不能完全去除基因组DNA，所以应根据后续实验的需求，选择是否需要在反转录反应前去除残留基因组DNA。
  
• M-MuLV Reverse Transcriptase（RNase H-）以RNA为模板获得第一链cDNA，其起始位点由所使用的引物决定：
  
  • 随机引物（RandomPrimer）在RNA模板上随机结合；
    
  • Oligo dTPrimer只能以poly(A) mRNA作为cDNA合成的模板；
    
  • 序列特异性引物（GSP）以其特异性结合位点为起始位点。
• M-MuLV RT（RNase H-）合成的第一链cDNA产物可直接加入PCR反应混合物中进行扩增，但加入体积不应超过PCR反应总体系的10%，否则影响目的片段的产量。PCR扩增使用的耐热DNA聚合酶和热循环条件需要根据目的片段的大小、GC含量、引物特性、以及对保真度的要求等进行选择。
  
• 第一链cDNA合成产物经过处理后可作为第二链合成的模板，合成含各种标记的cDNA，作为杂交实验的探针。
  
• RNA应置于-70℃以下保存，cDNA合成产物应置于-20℃保存。

• 溶液融化后轻轻混匀，短暂离心后冰浴放置。
  
• 按以下顺序在灭菌、无核酸酶的试管（冰浴放置）中加入以下成分：
  

  成分		用量
  模板	总RNA	1～5μg
  	poly(A) mRNA	0.1～0.5μg
  引物	Oligo(dT)18(50μM)	1μL
  	随机六聚体引物(50μM)	1μL
  	基因特异性引物(20μM)	1μL
  10mM dNTP Mix		1μL
  DEPC水		至10μL

• 65℃孵育5min后冰浴冷却，短暂离心后冰浴放置2min。
  
• 按指定顺序加入以下成分：
  

  成分	用量
  5×M-MuLV RT Buffer	4μL
  RNase inhibitor	0.5μL (20U)
  M-MuLV反转录酶(200U/μL)	1μL
  步骤3处理后的反应液	10μL
  DEPC水	至20μL

• 轻轻混匀后短暂离心。
  
• 如果使用oligo(dT)18引物或基因特异性引物，42℃孵育30～50min。如果使用随机六聚体引物，25℃孵育10min后再用42孵育60min。如果需逆转录富含GC的RNA，可将反应温度增加到45℃。
  注：如果合成的cDNA用作qPCR模板，则反应条件为42℃孵育15min即可，见qPCR实验中的反转录步骤。
  另：经测试，某些样品在反应温度为50℃时反转录的效率更高，因此可以采用50℃孵育50min以提高反转录效率
  
• 85℃加热5min使酶失活。
  
• 反应结束后所得的cDNA，请置于冰上进行后续实验或冷冻保存。

• 溶液融化后轻轻混匀，短暂离心后冰浴放置。
  
• 按以下顺序在灭菌、无核酸酶的试管（冰浴放置）中加入以下组分：
  

  成分		用量
  5×M-MuLV RT Buffer		4μL
  RNase inhibitor		0.5μL (20U)
  M-MuLV反转录酶(200U/μL)		1μL
  10mM dNTP Mix		1μL
  RNA模板	total RNA	≤ 1μg
  	或poly(A) mRNA	≤ 0.1μg
  引物	Oligo(dT)18	50μM
  	或随机六聚体引物	50μM
  	或基因特异性引物	20μM
  DEPC水		至20μL

• 轻轻混匀后短暂离心。
  
• 如用Oligo (dT)18或序列特异性引物，42℃孵育15min。如用随机六聚体引物（或含有随机六聚体引物的混合引物）,25℃孵育10min，42℃孵育15min。
  
• 85℃加热5min使酶失活。
  
• 反应结束后所得的cDNA，请置于冰上进行后续实验或冷冻保存。